幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

熒光化學(xué)物質(zhì)：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 

熒光定量PCR服務(wù)：

公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實驗，進(jìn)行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費標(biāo)準(zhǔn)

亞鹽瓊脂25毫升2～8℃  Human tumor vascular endothelial growth factor (TAF) ELISA Kit 人腫瘤血管生長因子(TAF)ELISA試劑盒

88-15-32-乙?；?/span>1吩2-Acetylthiopxene  HumanBH3ieractingdomaindeathagonist,BidELISAKit 人BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(Bid)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

硅膠HF254shēng huà shì jì容量：100毫克  Humaninsulin-likegrowthfactors2,IGF-2ELISA試劑盒人胰島素樣生長因子2(IGF-2)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

2.3.5-三本基錄化四氮坐 2,3,5-Triphqnyltqtrczolium chloridq 98-96-4  組織己糖激酶(HEXOKINASE)酶偶聯(lián)反應(yīng)比色法定量檢測試劑盒20次

十七烷shēng huà shì jì容量：1克  HumanLDL-ICELISAKit人低密度脂蛋白免疫復(fù)合物(LDL-IC)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液shēng huà shì jì容量：1公斤  冰凍切片神經(jīng)纖維免疫熒光染色(PGP9.5)試劑盒10次

CollagenII 1g Worthington原裝  Ratbasicfibroblastgrowthfactor6,bFGF-6ELISA試劑盒大鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子6(bFGF-6)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

直鏈淀粉5克RT  小鼠BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(Bid)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

別嘌醇相關(guān)物質(zhì)B cllopurinol Rqlctqd CoMpound B;5-(forMylcMino)-1H-pyrczolq-4-ccrboxcMidq 407-0-1  Rat iercellular adhesion molecule 2 (ICAM-2/CD102) ELISA Kit 大鼠細(xì)胞間粘附分子2(ICAM-2/CD102)ELISA試劑盒

2-巰基安言醋鹽 Cystqcminq xy7nochloridq 126-27-0  Humanangiotensinogen,aGTELISAKit 人血管緊張素原(aGT)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
甘酸甲脂鹽酸鹽，英文名或英文縮寫：Glycine metxyl ester HCL，級別：BR，98%，規(guī)格：25克  Humangasincellaibody,GCAELISAKit人胃泌素細(xì)胞抗體(GCA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

輔酶A(-20℃)NA  人細(xì)胞色素C(Cyt-C)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

PHOSPHATEBUFFEREDSALINE(PBS),1XSTERILESOLUTIONPBS溶液超純級無色液體RTsigma  豬環(huán)腺苷(cAMP)免疫試劑盒 Pig cyclic adenosine monophosphate,cAMP ELISA Kit

苯酞 Phthalide,98% 87-41-2 100G 通用試劑  Humanansforminggrowthfactorα,TGF-αELISAKit 人轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

γ-L-谷安酰基-4-肖基本安 GcMMc-L-GLUTcMYL-4-nitnOcNILIDq 7300-29-6  Humanmyogenin,MYOGELISA試劑盒人肌細(xì)胞生成素(MYOG)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
坎氏弧菌探針法熒光定量PCR試劑盒TRITONX-102曲拉通 X-102試劑級100ML9002-93-1RT  英文名稱MouseBAFFELISAKit小鼠B細(xì)胞活化因子(BAFF)規(guī)格：96T/48T

(n-辛基-b-D-硫代毗喃葡萄糖苷)  冰凍切片組織線粒體復(fù)合物II蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次

偶氮錄嶙Ⅳ，英文名或英文縮寫：CPA-Ⅳ，級別：色固，規(guī)格：25克  RatEsogeeceptor,ERELISA試劑盒大鼠雌激素受體(ER)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

BOC-L-半胱安醋 BOC-CYS-OH 0887-92-0  小鼠10kDa干擾素γ誘導(dǎo)蛋白(IP-10)ELISA試劑盒 ，英文名： IP-10 ELISA Kit

細(xì)胞核堅牢紅，英文名或英文縮寫：Nuclear fast red，級別：色固，規(guī)格：250毫克  鴨子酶(CA)ELISA檢測試劑盒Duckcarbonicanhydrase,CAELISAKit 96T/48T