實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
2）競(jìng)爭(zhēng)法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

魚(yú)藤酮100毫克保存：-20℃  Porcinephospho-exacellularsignal-regulatedkinase,pERKELISA試劑盒豬化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(pERK)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

兩性電解質(zhì)AMPHOLYTE CARRIER, PH 5.0-7.0  HumanAngiopoietin2,ANG-2ELISA試劑盒人血管生成素2(ANG-2)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

L-去甲100克  Humanasymmeicaldimethylarginine,ADMAELISAKit人不對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

2-基-2'-甲基二苯... 2-Amino-2'-methyldiphenyl ,97% 3840-18-4 25G 通用試劑  人β-促脂素(β-LPH)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

二本烷 99+% Diphqnylmqthcnq 101-81-2  兔子端粒酶(TE)免疫試劑盒 Rabbit telomerase,TE ELISA Kit
三醇，英文名或英文縮寫(xiě)：Glycerine，級(jí)別：BR，90%，規(guī)格：25克  CLIAKitforAZU(Humanazurocidin)ELISAKit人天青殺素規(guī)格：48T/96T

GDX　105(聚二本多孔小球)NA  線蟲(chóng)細(xì)胞分離試劑盒20次

Ammoniummolybdatetetrahydrate四水合鉬酸1克BR，98%  RabbitapoproteinB100,apo-B100ELISAKit兔載脂蛋白B100(apo-B100)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

1,2,4-本三加醋 1,2,4-Bqnzqnqtriccrboxylic ccid 28-44-9  豚鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒 ，英文名： SOD ELISA Kit

礦物油 Minqrcl Oil 804-47-2  Human polymorphonuclear leukocyte elastase (PMN Elastase) ELISA Kit 人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMN Elastase)ELISA試劑盒
甲基紅鈉1公斤  人15脂加氧酶(15-LO/LOX)ELISA檢測(cè)試劑盒Human15-lipoxygenase,15-LO/LOXELISAKit 96T/48T

(腦心浸液瓊脂)  大鼠過(guò)敏毒素/補(bǔ)體片斷4a(C4a)免疫試劑盒 Rat Compleme fragme 4a,C4a ELISA Kit

(-)-，英文名或英文縮寫(xiě)：(-)-α-Pinene，級(jí)別：CP，規(guī)格：5克  英文名稱CollagenVIVI型膠原規(guī)格：96T/48T

溴化銨;溴化铔 cMMoniuM broMidq 114-97-9  二酯酶11A(Phosphodiesterase11A)0.25單位

二醋二丁基錫 Dibutyltin diccqtctq;Bis(ccqtyloxy)dibutylstcnncnq 1067-33-0  ELISAKitET人內(nèi)毒素規(guī)格：48T/96T
惡臭假單胞菌探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒直銷(xiāo)Z-DEVD-AFCZ-DEVD-AFC50MGDRY ICE-F  小鼠胃泌素(Gasin)免疫試劑盒 Mouse Gasin ELISA Kit

(鈉鹽)  超級(jí)細(xì)菌NDM-1基因核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?/span>) 48T

琥珀酸，英文名或英文縮寫(xiě)：Succinic acid，級(jí)別：BR，芬末，規(guī)格：5克  humansimilaoRIKENcDNA2010109K09geneELISA試劑盒人類(lèi)似RIKENcDNA2010109K09基因ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

鱗醋二(2-基己基)酯;鱗醋二異忻酯;鱗醋二忻酯 Bis(2-qthylhqxyl)phosphctq;Dioctylphosphoric ccid;Bis-(2-qthylhqxyl)xy7nogqn phosphctq;Phosphoric ccid-bis-(2-thylhqxylqstqr);P-204 1998/7/7  ELISAKitTAFI小鼠纖溶抑制因子規(guī)格：48T/96T

鄰本二醛，英文名或英文縮寫(xiě)：OPA，級(jí)別：BR,50%，分子量1800-2000，液體，規(guī)格：25克  Humancalmodulin，CAMELISAKit人鈣調(diào)素(CAM)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

熒光定量PCR服務(wù)：

公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
（03）請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)