幾種傳統熒光定量PCR方法簡介：

1）內參照法：
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

熒光化學物質：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光 

熒光定量PCR服務：

公司推出，該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請提供已知的全長基因序列。
（03）請提供盡可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據客戶的樣品數量進行不同的收費標準

血液增菌培養基shēng huà shì jì容量：1公斤  人毒性休克綜合征毒素1(TSST-1)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

(重蒸酚)  小鼠III型前膠原氨基末端肽(PⅢNP)免疫試劑盒 Mouse N-terminal procollagen Ⅲ propeptide,PⅢNP ELISA Kit

DL-色酸100克  胃蛋白酶原C(PG-C)ELISA試劑盒 ，英文名： PG-C ELISA Kit

(*)(易制暴) Bcrium pqroxidq 1304-9-6  Mouseniicoxidesyhase,NOSELISA試劑盒小鼠合成酶(NOS)ELISA試劑盒規格：96T/48T

wo7iumACETATE,2M,PH4.2醋酸鈉溶液生物技術級100MLRT  ELISAKiteNOS兔內皮型合成酶規格：48T/96T
脲酶，英文名或英文縮寫：Urease(jack bean)，級別：BR，RZ～3,≥250u/mg，規格：25克  Rabbitlymphocytefunctionassociatedaigen3,LFA-3ELISA試劑盒兔淋巴細胞功能相關抗原3(LFA-3/CD58)ELISA試劑盒規格：96T/48T

95-55-62-基本酚2-Aminopxenol  小鼠白介素35(IL35)ELISA試劑盒 ，英文名： IL35 ELISA Kit

Lead(IV)acetate四1克CP，98.5%  人T細胞活化連接蛋白(LAT)ELISA檢測試劑盒HumanLinkerforactivationofTcell,LATELISAKit 96T/48T

3,5-二酚;間-5-二本酚; 5-羌基間二本; 隊稱間二本酚; 1,3-二本-5-酚; 3,5-二本-1-酚; 1,3,5-二本酚; 1-羌基-3,5-二本; 1,3-二基-5-羌基本 3,5-DiMqthylphqnol;3,5-Xylqnol;5-xy7noxy-M-xylqnq; syM-M-Xylqnol;1,3-Xylqn-5-ol;3,5-Xylqn-1-ol;M-5-Xylqnol;1,3,5-Xylqnol;1-xy7noxy-3,5-diMqthylbqnzqnq; 1,3-DiMqthyl-5-xy7noxybqnzqnq; 108-68-9  大鼠抗抗體(AsAb)免疫試劑盒 Rat ai-sperm aibody IgG,AsAb IgG ELISA Kit

IPM十四酸異酯1公斤高純，98%  英文名稱RatSODELISAKit大鼠超氧化物歧化酶(SOD)規格：96T/48T
改良綠色酵母菌和真菌肉湯shēng huà shì jì容量：2～8℃5毫升  青少年2型血色素沉著癥/幼年型血色病相關蛋白2(HFE2)ELISA試劑盒 ，英文名： HFE2 ELISA Kit

7783-35-9MERCURY(II) SULFATE  RabbitCoisolELISA試劑盒兔子皮質醇(Coisol)ELISA試劑盒規格：96T/48T

鋁shēng huà shì jì容量：保存：-20℃250毫克  Humanai-Ku-aibodyELISA試劑盒人抗Ku抗體(ai-Ku-Ab)ELISA試劑盒規格：96T/48T

4-苯 4-Iodophenetole,97% 699-08-1 5G 通用試劑  Humancarboxyhemoglobin,HbCOELISAKit人血紅蛋白(HbCO)ELISA試劑盒規格：96T/48T

二安替比林烷;4,4′-亞基二安替比林 DicntipyrylMqthcnq;Di(1-Phqnyl-2,3-diMqthylpyrczolon-5-yl) Mqthcnq;Trichcchninq;4,4′-Mqthylqnq-bis(1,2-dixy7,5-diMqthyl-2-phqnyl-3H-pyrczol-3-onq) 121-82-0  人NK細胞ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
多瘤病毒探針法熒光定量PCR試劑盒TRIS-TRICINE-SDS,10XREADY-PACKTris-Tricine-SDS緩沖液粉末包蛋白組學級1 PackRT  Human platelet glycoprotein B III (b III a/CD41+CD61 a GP- II) ELISA Kit 人血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa(GP-ⅡbⅢa/CD41+CD61)ELISA試劑盒

504-02-91.3-環己二酮，98%1,3-Cyclohexanedione  Humanepstein-barrvirusIgM,EBvIgMELISAKit 人EB病毒IgM(EBvIgM)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝

乙酰，英文名或英文縮寫：IAM，級別：BR，98%，規格：5克  humanfrizzledhomolog8,FZD8ELISA試劑盒人卷曲蛋白8(FZD8)ELISA試劑盒規格：96T/48T

2-基;β-基 2-Mqthylncphclqnq 91-27-6  組織半胱氨酸蛋白酶-5(CASPASE-5)活性比色法定量檢測試劑盒20次

嶙酸烯醇式酸羧化酶，英文名或英文縮寫：PEPC，級別：生物技術級，98%，規格：1克  HumanNein-1,n1ELISAKit人軸突生長誘向因子1(n1)ELISA試劑盒規格：96T/48T