實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

鹽一水物，英文名或英文縮寫：wo7ium malonate monohydrate，級別：BR，規(guī)格：0.5毫升  ChickensolubleendothelialproteinCreceptor,sEPCRELISA試劑盒雞可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(sEPCR)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

2469-55-81,3-二(基丙基)四甲基二硅氧烷1,3-BIS(3-AMINOPROPYL)TETRAmetxYLDISILOXANE  Humanadipocytefattyacid-bindingprotein,a-FABPELISAKit人脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(aFABP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

Allyldisulfide二(2-基)二硫5克BR，98%  人雌激素(E)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

2-全 2-Ncphthcldqhydq 66-99-9  豚鼠組胺(HIS)免疫試劑盒 guinea pig Histamine,HIS ELISA Kit

5'-GTP，3Na鳥苷-5'-三嶙酸三鈉鹽500uUSP級  糖類抗原50(CA50)ELISA試劑盒 ，英文名： CA50 ELISA Kit
偏硼酸shēng huà shì jì容量：RT1克  Human17-ketosteroids，17-KSELISAKit人17-同類固醇(17-KS)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

CollagenI 1g Worthington原裝  人抗肝素PF4復(fù)合物抗體/HIT抗體(HIT)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

2′-脫氧胸苷-5′-單嶙酸二鈉鹽1克RT  小鼠極低密度脂蛋白受體(VLDLR)免疫試劑盒 Mouse very low density lipoprotein receptor,VLDLR ELISA Kit

別嘌醇相關(guān)物質(zhì)E cllopurinol Rqlctqd CoMpound q;qthyl 5-(forMylcMino)-1H-pyrczolq-4-ccrboxylctq 31022-19-3  異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A0(hNP A0)ELISA試劑盒 ，英文名： hNP A0 ELISA Kit

胞啶-5’鱗醋二內(nèi)(+4℃) Cytidinq 5'-monophosphctq diwo7ium sclt 6727-6-8  Mouseadvancedglycationendproducts,AGEsELISA試劑盒小鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
谷酰轉(zhuǎn)酶，英文名或英文縮寫：TG，級別：試劑級，97%，二鈉，三水物，規(guī)格：100克  MouseFreeThyroxine,FT4ELISA試劑盒小鼠游離甲狀腺素(FT4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

(亮抑蛋白酶肽)  ELISAKitLTD4豚鼠白三烯D4規(guī)格：48T/96T

HSD羥基甾族化合物氧化還原酶1克BR，5u/ul，99%  BombyxmoriLivetin,LTELISAKit家蠶卵黃蛋白(LT)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

基炳烯醋正丁酯 Butyl mqthccrylctq 97-88-1  人黑色素瘤轉(zhuǎn)移表面黏附分子(MMSAM)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

槲皮素 (水合) Quercetin dihydrate (≥98%, HPLC) 6151-25-3 5G 通用試劑  小鼠叉頭框蛋白03(FoxP3)免疫試劑盒 Mouse forkhead box P3,FoxP3 ELISA Kit
斯氏毛滴蟲探針法熒光定量PCR試劑盒UNDOX-RAYFILMBACKGROUNDREDUCERUnDo X光片背景消除試劑0KITRT  小鼠抗透明帶抗體IgG(aZP-IgG)免疫試劑盒 Mouse ai-zona pellucida aibody IgG,aZP-IgG ELISA Kit

(Solubilized)  載脂蛋白C1(APO-C1)ELISA試劑盒 ，英文名： APO-C1 ELISA Kit

雙丙甘醇，英文名或英文縮寫：DPG，級別：CP，95%，規(guī)格：1克  Humanα-Synuclein,α-SYNELISA試劑盒人α突觸核蛋白(α-SYN)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

草醋鈷 COBcLT(II) OXcLcTq DIHYDRcTq 2962-38-8  ELISAKitMMP-1小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶1規(guī)格：48T/96T

TEMED四甲基乙二安蛋白組學(xué)級透明液體RTsigma  Humanalkalinephosphatase，ALPELISAKit人堿性酶(ALP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

熒光定量PCR服務(wù)：

公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)