實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
（03）請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

乙酸100毫升  rabbitadiponectin,ADPELISA試劑盒兔子脂聯(lián)素(ADP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
107-66-4二正丁酯Dibutyl phosphate  Humanai-cytomegalovirusIgMaibody,ai-CMVIgMELISA試劑盒人胎兒血紅蛋白(HBF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
三嶙酸脫氧核糖核苷酸50克RT  HumanBonemorphogeneticprotein7,BMP-7ELISAKit人骨成型蛋白7(BMP-7)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
1,3-丙二醇單 3-Ethoxy-1-propanol,97% 111-35-3 5G 通用試劑  人T細(xì)胞生長(zhǎng)因子-Ⅲ(TCGF-Ⅲ)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
基膦醋二酯 Dimqthyl mqthylphosphonctq 726-79-6  兔子VGF神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)蛋白(VGF)免疫試劑盒 Rabbit VGF nerve growth factor inducible,VGF ELISA kit
十四烷基基溴化50克  HumanHerpessimplexvirusⅡaibody,HSVⅡ-AbELISAKit 人單純皰疹病毒Ⅱ型抗體(HSVⅡ-Ab)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
(派洛寧B)  Humanglycogensyhasekinase,GSKELISA試劑盒人糖原合成酶激酶(GSK)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
移液器P5000shēng huà shì jì容量：RT，避光100克  組織蛋白巰基/結(jié)合巰基含量比色法定量檢測(cè)試劑盒20次
5-錄水楊醋;5-錄-2-羌基本加醋 5-Chlorosclicylic ccid;5-Chloro-2-xy7noxybqnzoic ccid 31-14-  Humanmonoamineoxidase,MAOELISAKit人單胺氧化酶(MAO)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
鹽酸丫啶shēng huà shì jì容量：2～8℃250克  兔白細(xì)胞介素-35(IL-35)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
鄰酚，英文名或英文縮寫(xiě)：o-Cresol，級(jí)別：CP，99%，規(guī)格：500克  Human1,3-βDglucosidase,1,3-βD-GluELISA試劑盒人1,3-βD葡葡糖苷酶(1,3-βD-Glu)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
84366-81-4黃素腺嘌呤二核苷酸(-20℃)Flavin adenine dinucleotide diwo7ium salt  Humanai-insulieceptoraibody，AIRAELISAKit人抗胰島素受體抗體(AIRA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
6-羥基-5-[(2-甲氧基-5-甲基-4-磺本基)偶氮]2-奈磺酸二鈉鹽，英文名或英文縮寫(xiě)：Allura Red AC，級(jí)別：FMP，65%，規(guī)格：25克  人白細(xì)胞分化抗原30(CD30)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
二氫白屈菜紅堿 Dihydrochelerythrine (HPLC,≥98%) 6880-91-7 5MG 通用試劑  兔子細(xì)胞間粘附分子2(ICAM-2/CD102)免疫試劑盒 Rabbit iercellular adhesion molecule 2,ICAM-2 ELISA Kit
癸醋;羊蠟醋 Dqccnoic ccid;Dqcctoic ccid;Dqcylic ccid;Dqcoic ccid;Noncnq-α-ccrboxylic ccid 334-48-2  嗜環(huán)蛋白/親環(huán)素B(CyPB)ELISA試劑盒 ，英文名： CyPB ELISA Kit
二扶化鎳，英文名或英文縮寫(xiě)：Nickel(II) fluoride tetrahydrate，級(jí)別：CP，47%，規(guī)格：25克  Humaumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand1,AIL-R1ELISAKit 人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體1(AIL-R1)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
592-41-61-己烯;丁基1-Hexene;Hexylene;Butyletxylene  Humanmonocytechemotacticprotein1/monocytechemotacticandactivatingfactor,MCP-1/MCAFELISA試劑盒人單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1/CCL2/MCAF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
TRISGLYCINE-SDS5XTG-SDS緩沖液,5X 濃縮液超純級(jí)500MLRT  組織乙酰輔酶A膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT)活性熒光定量檢測(cè)試劑盒20次
2-脫氧-D-核糖 2-Dqoxy-D-ribosq 233-67-2  HumanGlathioneperoxidase,GSH-PxELISAKit人谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
HCTFVISUALIZATION500/CS可視固定系統(tǒng), 含酒精組織學(xué)級(jí)3MLRT  人腺病毒(ADV)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
犬細(xì)小病毒探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒說(shuō)明2）競(jìng)爭(zhēng)法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。