大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書 本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中超敏C反應蛋白（hs-CRP）的含量。 實驗原理： 本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）水平。用純化的大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP），再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）含量。 試劑盒組成： 試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存 說明書 1份 1份 封板膜 2片 2片 密封袋 1個 1個 酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存 標準品 0.3ml×6管 0.3ml×6管 2-8℃保存 酶標試劑 5 ml×1瓶 10 ml×1瓶 2-8℃保存 樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 終止液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 20×濃縮洗滌液 15ml×1瓶 25ml×1瓶 2-8℃保存 注：標準品濃度依次為：120、60、30、15、7.5、0 ng/mL. 樣本處理及要求： 1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。 2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。 3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。 4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。 5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。 6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融. 7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟 1.標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。 2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 3.加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。 4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。 5.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。 7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. 8.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。 9.測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。 注意事項： 1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。 2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。 3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間hao控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 4．請每次測定的同時做標準曲線，hao做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物請避光保存。 7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準. 8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 9．本試劑不同批號組分不得混用。 10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。 計算： 以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標， 在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋 倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標 準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值 代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數，即為樣品的實際濃度。 （此圖僅供參考） 試劑盒性能： 1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。 2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。 檢測范圍： 3.75 ng/mL - 120 ng/mL 靈敏度： 低檢測濃度小于0.1 ng/mL 保存條件及有效期： 1.試劑盒保存： 2-8℃。 2．有效期： 6個月 |
