1、 海水派琴蟲感染PCR檢測試劑盒簡介
貨號：HB-905
為了適應貝類海水派琴蟲（Perkinsus marinus）的快速檢測和疫病監測的需要，本公司嚴格
依據 2014 年 OIE 水生動物疫病診斷手冊中規定的相應 PCR 檢測引物序列及其循環參數等技術標準，
在本公司嚴謹的產品質量保證體系管控下和質檢。確保本試劑盒滿足 OIE 中海水派琴蟲的檢測
標準要求。本試劑盒具有快速靈敏、特異、準確 、安全、操作簡單、應用廣泛等特點及優點。
2、 試劑盒組成
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積
核酸提取試劑： 樣品 DNA 提取液 1
樣品 DNA 提取液 2
5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
海水派琴蟲 PCR 反應液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對照
海水派琴蟲陽性對照
5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。
3、 樣本采集，存放及運輸
3.1 樣本采集
取新鮮貝類的消化腺上皮、腮、觸須等組織25 mg置于冰冷的生理鹽水中反復沖洗，濾紙吸干表
面水分后稱重(根據需要)，置于勻漿研磨器中并加入冷的生理鹽水，進行手工勻漿研磨。注意整個
過程在冰上完成。
3.2 存放
研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h；-70 ℃以下可長期保存，但應避免反復
凍融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運輸
采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、 檢測步驟
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區進行)：
4.1.1 取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數和一管陰性對照之和，對每個管進行
編號標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用
一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃
條件下，2 000 r/min 離心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內保存）。
4.2 PCR 檢測
4.2.1 海水派琴蟲感染PCR檢測試劑盒擴增試劑準備（在反應混合物配制區進行）：
從試劑盒中取出 PCR 反應液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應體系配制見下表
2。
表 2 每個樣品測試反應體系配制表
試劑 PCR 反應液 Taq 酶 合計
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加樣（樣本處理區進行）：
向每個PCR管中各分裝15μL的混合液，再分別加入樣本DNA模板10μL，蓋緊管蓋，500 r/min
離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測（在檢測區進行）：
循環條件設置：
*階段，95 o
C /4 min；
第二階段，94 o
C/1 min，57 o
C/1 min；65 o
C/3 min; 40個循環；
第三階段，65 o
C/10 min;
第四階段，4 o
C 保存
4.3 瓊脂糖電泳
用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠
面。將PCR擴增產物和相應電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時
設立DNA標準分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h，當溴酚藍到達底部時停止。在紫外燈下或凝膠成
像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。
5、 結果判定
5.1 海水派琴蟲的PCR后陽性對照會出現一條509 bp的DNA片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。
5.2 待測樣品 PCR 擴增后能在相應 509 bp DNA 位置上有帶，可判為海水派琴蟲陽性。
6、 相關技術信息
6.1 海水派琴蟲感染PCR檢測試劑盒引物序列
F：5’-CTT-TTG-YTW-GAG-WGT-TGC-GAG-ATG-3’
R：5’-CGA-GTT-TGC-GAG-TAC-CTC-KAG-AG-3’ |
