我們在明膠酶譜分析ELISA試劑盒時候的注意事項： 1.制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。 2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。 3.用大梳子 4.孵育液的PH在7.5-7.6，復性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。 5.孵育的37度不要在CO2培養箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。 明膠酶譜分析試劑盒檢測步驟： 1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。 2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染Marker 即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。 3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。 4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。 5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應延長孵育時間為10小時或過夜。 6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域。透明區域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現透明條帶。 7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。 |
