過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強烈，各批實驗結(jié)果不易重演。 按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過*洗滌，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色。ELISA試劑盒但游離的抗體則不同，它會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。
ELISA試劑盒中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應(yīng)是隨機的，酶與抗體交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。諏講椒ㄖ校?br> 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。ELISA試劑盒也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。 |
