【實驗原理】 如圖所示，親和層析的高度選擇性使得從某一初始材料中純化，富集某一含量較低的目的蛋白成為可能，因此親和層析是蛋白質分離純化過程中zui有效的方法之一。另外，如果配基與蛋白質的親和能力很強，也可同時進行樣品的濃縮。 雖然多數情況下不需要將抗體與其他血清蛋白分開，但如果一旦需要，蛋白A親和層析是一種非常有效的分離方法。蛋白A是從Staphylococcus aureus中獲得，可與抗體重鏈的Fc片段相結合。現在已知蛋白A可與多種哺乳動物的IgG相結合也可與某些IgM和IgA相結合。如果將蛋白A與固相載體相連，例如sepharose CL-4B，這種填料可以成為分離和純化不同類型，不同亞類抗體或抗體片斷的重要工具。 【實驗材料】 ⒈.實驗儀器 蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；離心管；離心機；pH試紙；過濾器；玻璃柱。 ⒉.實驗試劑 ⑴ TBS緩沖溶液：6.06g Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150mM)以及0.5g*(0.05%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調節pH 7.4。 ⑵ 中和緩沖溶液：121.2g Tris (1 M), 87.8g NaCl(1.5 M), 0.37g EDTA (1mM)及5g*(0.5%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調節pH8.0。 ⑶ 洗脫緩沖溶液(pH2.7)：將3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調節pH 2.7。 ⑷ 洗脫緩沖溶液(pH1.9)：將3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調節pH 1.9。 【實驗方法】 1. 親和層析 將抗體用TBS緩沖溶液以1：5的比例進行稀釋，再用過濾器進行過濾。以每分鐘0.5 ml的速度將抗血清上到柱上,為保證抗血清與填料的結合，需連續上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脫緩沖溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經加入100ul中和緩沖溶液的1.5 ml EP管分管收集洗脫液，混勻后用pH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調至約pH7.4以防止抗體的變性。 在柱中加入10ml，pH1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至Aλ280nm<0.008。<> 利用分光光度計測定各管中蛋白質的含量。若蛋白濃度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝后在2oC~8oC保存。 用含0.05%*的TBS緩沖溶液清洗柱子后將柱子儲存在2oC~8oC環境。 2. 準備蛋白A sepharose CL-4B親和柱 通常準備5ml或10 ml蛋白Asepharose CL-4B填料，在真空瓶中將等體積的填料和TBS緩沖溶液混合，攪拌。抽真空約15分鐘以除去填料中的氣泡，否側在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將蛋白Asepharose CL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用10倍于床體積并經過預冷的TBS緩沖溶液平衡柱子。 3. 制備抗血清 將抗血清放入冰水或4oC冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質的聚集。在蛋白質解凍過程中出現的聚集可通過37oC預熱而溶解。抗體加入固體*至濃度為0.05%，4oC，15,000xg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經過濾器過濾除去多余的脂。 【實驗結果】 利用SDS/PAGE檢查洗脫獲得的蛋白純度并利用免疫電泳技術檢查純化后抗體的滴度。 【注意事項】 ⒈ *有毒，應戴手套并小心操作 ⒉ 在純化過程中，預冷的TBS緩沖溶液可減少抗體蛋白質的非特異性結合和微生物的代謝。 |
