一、原理 Gus (b-glucuronidase)基因作為一種報(bào)告基因，在植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中有廣泛的用途。Gus基因來自于大腸桿菌，編碼b－葡聚糖苷酶（一種水解酶），可催化底物5－溴－4－氯－3－吲哚葡聚糖醛酸苷（5－bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，縮寫為X－Gluc）分解，產(chǎn)生肉眼可見的深蘭色化合物，借此用來觀察轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的表達(dá)情況，鑒定轉(zhuǎn)基因植株。ELISA試劑盒 二、目的 了解轉(zhuǎn)基因植物中基因表達(dá)的器官、組織和細(xì)胞的特異性，掌握Gus報(bào)告基因表達(dá)的組織化學(xué)定位的方法。 三、材料與試劑 1、轉(zhuǎn)基因植物的組織、器官、種胚或幼苗。 2、同種非轉(zhuǎn)化植物的組織、器官、種胚或幼苗。 3、50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)。 4、染色液：100mM K3[Fe(CN)6], 100mM K4[Fe(CN)6] 10mM Na2EDTA, 0.001% (v/v) triton X-100, 20%甲醇，0.5mg/ml X-Gluc, 磷酸緩沖液(50mM, pH 7.0)。 5、70％乙醇。 四、操作步驟 1、將準(zhǔn)備好的材料沖洗干凈，用吸水紙吸干，浸在上述染色液中37℃恒溫條件下保溫過夜。 2、轉(zhuǎn)入70％乙醇中脫色2－3次，去除葉綠素，至陰性對(duì)照材料呈白色時(shí)為止。ELISA試劑盒 3、肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的蘭小點(diǎn)即為Gus基因表達(dá)的位點(diǎn)。 4、83％、95％、100％乙醇中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。 5、常規(guī)石蠟切片法切片，番紅染色。 6、顯微鏡下觀察、拍照。 五、說明 1、要設(shè)立嚴(yán)格的陰性對(duì)照，即用同樣的未轉(zhuǎn)化的材料按相同的方法同時(shí)進(jìn)行染色。如陰性對(duì)照顯示蘭色，其原因可能是：A）材料和試劑被細(xì)菌感染；B）保溫時(shí)間過長(zhǎng)。 2、染色液中的甲醇可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素，短時(shí)間染色也可以不加。 3、葉綠體含量高的材料染色后要進(jìn)行脫色。ELISA試劑盒 |
會(huì)員_a.png)