動物細胞分離培養室用無菌操作的方法將動物體內的組織(或器官)取出，模擬動物體內的生理條件，在體外進行培養，人們借以觀察細胞的生長、增殖和細胞分化以及細胞凋亡或死 亡的過程。因為分離的細胞沒有免疫防御系統，所以動物細胞分離操作需要比外科手術更加 嚴格的無菌操作，無菌操作的原則就是保證細胞分離過程中的操作環境，使用的器械、耗材以及試劑無菌。 1)硬件準備 ①儀器：超凈工作臺、離心機、倒置顯微鏡、培養箱、冰箱、高壓蒸汽消毒裝置、移液器。 ②器械：止血鉗、手術刀、眼科剪、手術剪、鑷子，細胞過濾篩等。所有器械清洗完以后，使用棉布包裹，捆好后濕熱滅菌。 ③耗材：培養皿、培養瓶、離心管(15 mL和50 mL)、巴氏吸管(或玻璃吸管)、移液管、燒杯。如果購買的是無菌包裝的一次性耗材可以直接使用，如果是玻璃材質的用品，建議使用高壓蒸汽滅菌。 ④試劑：75％的酒精、碘酒、O．9％的生理鹽水、DBSS、胰蛋白酶、DMEM(或PRMI-1640)液體培養基、抗血凝劑、血清、二甲基亞砜(DMSO)。所使用的液體溶劑大部分使用過濾除菌的方式保證無菌。培養基在使用前先在37℃水浴中升溫。酶儲液放置于一20℃，稀釋以后放在4 ℃中保存，因胰蛋白酶在37 ℃中降解比較快，所以不建議酶升溫至37℃再使用，可以直接從4℃中取出用完后盡快放回冰箱。因為動物組織比較珍貴，建議試劑在使用前先測試是否染菌。 ⑤其他：冰塊、脫脂棉球、封口膜、記號筆。 2)實驗室的清潔 實驗室一般采用照射或者熏蒸的方法消毒。熏蒸常使用過氧乙酸蒸氣進行熏蒸，在動物細胞的體外培養中較少使用，一般使用紫外照射的方法滅菌。實驗室在使用前半個小時打開紫外燈照射，雖然照射也可以對操作桌面滅菌，但因為紫外線容易被桌面上放置的物品擋住，導致桌面的滅菌受到影響，所以如有需要可以在使用前先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3％。來蘇爾或0．1％新潔爾滅或O．5％過氧乙酸擦拭。紫外照射的時候也可以預先將實驗中用到的物品放到實驗臺的邊緣，進一步降低實驗中可能存在的污染風險，照射前檢查實驗中所需要的物品是否已經準備妥當(如檢查酒精燈中的酒精量是否可以保證實驗的完成)，避免實驗進行中因為缺少試劑或器械而導致實驗被迫終止。 實驗人員無菌操作前需要用肥皂清洗雙手及手臂，用清水沖干凈，穿好滅菌工作服，戴好口罩和帽子，進行操作前用75％的酒精擦洗雙手，如戴乳膠手套，乳膠手套也要擦拭75％的酒情。可以將消毒用的酒精裝到一個噴壺里面，這樣保證酒精噴灑均勻；也可以將脫脂棉球放到裝有酒精的廣13瓶中，使用時用鑷子取出棉球擦拭手和乳膠手套。 在超凈臺里面進行無菌操作時，所使用的試劑和器材在使用前應用火焰灼燒，如培養瓶的打開和擰緊的操作，一般使用酒精燈火焰灼燒。一般使用的金屬器械不能進行長時間灼饒，避免損傷器械，導致生銹；金屬器械要等到冷卻以后再取動物組織。吸取過培養基和血清的耗材不能在火焰上加熱太長時間，避免其中的蛋白等物質受熱產生有害物質，從而影響細胞的生長。 |
