研究人員描述了一種能克服ELISA試劑盒問題的新方法。這種被稱為siPools的低成本方法，能夠簡單而的生成含有多達(dá)60種siRNA的混合物，將脫靶效應(yīng)降低到檢出限以下。 據(jù)介紹，siPools的關(guān)鍵一步是，設(shè)計(jì)針對同一個(gè)基因的幾十種siRNA，并將這些序列結(jié)合到一個(gè)DNA模板上，不同siRNA序列之間以短序列相連。這些模板經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、退火和酶切就能生成成分明確的siRNA混合物。（延伸閱讀：如何優(yōu)化你的RNAi） 為了驗(yàn)證siPools的效果，研究人員選擇人類基因POLG和SCYL1作為RNAi的靶標(biāo)。之前有研究顯示，針對這兩個(gè)基因的siRNA很容易影響到MAD2基因的表達(dá)，因此它們可以作為檢測脫靶效應(yīng)的理想對象。 研究人員針對這兩個(gè)基因，ELISA試劑盒分別設(shè)計(jì)了含有60個(gè)siRNA的siPools，然后用它們轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。研究顯示，在濃度相同的情況下，siPools敲低目標(biāo)基因與單個(gè)siRNA一樣有效。 這兩個(gè)siPools都含有一個(gè)MAD2脫靶效應(yīng)很強(qiáng)的siRNA。然而在轉(zhuǎn)染之后，MAD2上并未發(fā)生可檢測到的脫靶影響。研究人員隨后又通過螢光素酶報(bào)告基因證實(shí)了這一點(diǎn)。 此外，研究人員還進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組的芯片分析。他們發(fā)現(xiàn)，單個(gè)脫靶siRNA除了MAD2以外還大大減少了許多其他的轉(zhuǎn)錄本，但siPools對MAD2和總體轉(zhuǎn)錄本水平都沒有影響。這說明，將大量siRNA混合起來的確能夠大大降低RNAi的脫靶效應(yīng)。下一步，Meister將進(jìn)一步評估siPools在活體內(nèi)作用效果。 值得注意的是，ELISA試劑盒研究人員還將siPools成功用于長非編碼RNA（lncRNA）。單個(gè)siRNA往往難以對lncRNA施加影響，這可能是因?yàn)閱蝹€(gè)siRNA難以接觸到高度結(jié)構(gòu)性的lncRNA分子。現(xiàn)在，研究團(tuán)隊(duì)正在構(gòu)建針對lncRNA的siPool文庫。 |
